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Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 310 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ein erheblicher Prozentsatz der Bevölkerung ist von der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD) betroffen. Aufgrund der Ungeeignetheit von In-vitro-Tests und Tierversuchsmodellen wurden jedoch noch keine wirksamen Behandlungen etabliert. Hier präsentieren wir eine integrierte Darm-Leber-auf-einem-Chip-Plattform (iGLC) als In-vitro-Menschenmodell der Darm-Leber-Achse (GLA) durch gemeinsame Kultivierung menschlicher Darm- und Leberzelllinien, die über Mikrofluidik miteinander verbunden sind geschlossener Kreislauf zur Einleitung und Progression von NAFLD durch Behandlung mit freien Fettsäuren (FFAs) für 1 bzw. 7 Tage. Co-kultivierte Caco-2-Darm-ähnliche Zellen und HepG2-Hepatozyten-ähnliche Zellen zeigen die schützende Wirkung von Apoptose gegen die Behandlung mit FFAs, wohingegen monokultivierte Zellen induzierte Apoptose zeigen. Phänotyp- und Genexpressionsanalysen zeigen, dass die mit FFAs behandelten Darm- und Leberzellen intrazelluläre Lipidtröpfchen ansammelten und einen Anstieg der Genexpression zeigten, der mit einer zellulären Reaktion auf Kupferionen und Stress des endoplasmatischen Retikulums verbunden ist. Als in vitro menschliches GLA-Modell könnte die iGLC-Plattform als Alternative zu Tierversuchen zur Untersuchung der Mechanismen von NAFLD dienen.

Die nichtalkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) ist eine häufige chronische Lebererkrankung, die zu Lebersteatose, Leberzirrhose, Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen führt1,2,3,4. Schätzungen zufolge werden bis zum Jahr 2030 33,5 % der US-Bevölkerung über 15 Jahren von NAFLD betroffen sein5. Derzeit ist eine Lebertransplantation die einzige Methode zur Heilung von Patienten mit schweren Lebererkrankungen, und es ist äußerst schwierig, passende Spender zu finden. Es besteht ein dringender Bedarf an Interventionen in verschiedenen Stadien der Fettlebererkrankung; Allerdings ist der Krankheitsmechanismus aufgrund der komplizierten Prozesse, die auf mehreren Ebenen ablaufen, bekannt als Multiple-Hit-Theorie, weitgehend unbekannt. Beispielsweise können Fettansammlung, oxidativer Stress, endoplasmatischer Retikulum (ER)-Stress und genetische oder epigenetische Veränderungen auf zellulärer Ebene auftreten, während Insulinresistenz und Entzündungsreaktionen je nach Person und Umgebung in mehreren Organen auftreten können6. Um neue Behandlungsmöglichkeiten für NAFLD zu finden, ist ein tiefes Verständnis jedes dieser Prozesse erforderlich, und dieses gesammelte Wissen muss dann kombiniert werden.

In dieser Studie haben wir uns auf die Darm-Leber-Achse (GLA) konzentriert, die eine der wichtigsten Komponenten für die Entstehung und das Fortschreiten von NAFLD7,8 ist. Der Darm wird stark von der Darmmikrobiota und den Kohlenhydraten aus der Nahrung beeinflusst, was die NAFLD beschleunigen kann9,10,11. Entzündungsprodukte, Nährstoffe und Substanzen, die über die Darmbarriere aus der Nahrung und der Mikrobiota aufgenommen werden, werden über das venöse Blut zur Leber transportiert. Darüber hinaus werden die von den Hepatozyten erzeugten Produkte in den Dünndarm transportiert. Daher sind Darm und Leber sowohl physiologisch als auch pathologisch eng miteinander verbunden. GLA-Dysfunktionen, einschließlich intestinaler Dysbiose, bakterieller Überwucherung und Veränderung der Schleimhautpermeabilität, die durch NAFLD verursacht werden, sind potenzielle therapeutische Ziele;12,13, aber bisher wurden keine Behandlungen kommerziell verfügbar gemacht. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, dass herkömmliche präklinische Tierversuche die Probleme der Multiple-Hit-Theorie nicht genau abbilden, dass einzelne Organe lebender Tiere nicht zugänglich sind und dass es zu Artenunterschieden kommt. Daher ist die Etablierung eines vereinfachten und robusten Modells zur Untersuchung von GLA bei NAFLD von entscheidender Bedeutung, um tiefere Einblicke in die Mechanismen zu erhalten, die der Entdeckung neuer Medikamente, Behandlungen und Diagnoseinstrumente zugrunde liegen.

Organs-on-Chips (OOCs), die auch als mikrophysiologische Systeme (MPSs) bekannt sind, bergen ein erhebliches Potenzial für präklinische In-vitro-Tests14,15,16,17 und Krankheitsmodellierung18. Mikrofluidik-Technologie ist die Grundlage von OOCs, da sie eine präzise Steuerung des Flüssigkeitsflusses und der dreidimensionalen Architektur von Strömungskanälen ermöglicht. Diese Eigenschaften verleihen OOCs die Fähigkeit, zelluläre Mikroumgebungen räumlich und zeitlich zu kontrollieren und Gewebezellen zu funktionalisieren. Die Zirkulation des Zellkulturmediums kann außerdem bei der Modellierung von Multiorgan-Interaktionen mit parakrinen und endokrinen Signalen hilfreich sein. OCCs liefern in Kombination mit fortschrittlichen Zelltests wie High-Content-Analysen und dem Omics-Ansatz tiefergehende Einblicke in die Biologie auf quantitative und multiparametrische Weise als Tierversuche19. OOCs wurden verwendet, um GLA in vitro zu rekapitulieren und um die Rolle des Crosstalks über die GLA in pathologischen Situationen, einschließlich Fettlebererkrankungen20,21 und Entzündungen22, für pharmakokinetische In-vitro-Studien23 zu demonstrieren. Allerdings müssen OOCs weiter verbessert werden, um die GLA nachzuahmen, und dies erfordert vier Schlüsselmerkmale: einen geschlossenen Zirkulationskreislauf, Zugänglichkeit zu einzelnen Kammern, dynamische Flusskontrolle und Verhinderung der Molekülabsorption. Der geschlossene Zirkulationskreislauf ist für die mittlere Zirkulation erforderlich, um die Wechselwirkungen zwischen den Geweben in der GLA wiederherzustellen. Eine individuelle Zugänglichkeit ist erforderlich, um Gewebezellen in die gewünschte Kammer einzuführen und sie nach der Behandlung ohne Kreuzkontamination durch andere Zellen zu ernten. Der geschlossene Kreislauf und die individuelle Zugänglichkeit scheinen widersprüchliche Merkmale zu sein, aber beide sind notwendig, um die Wechselwirkung zwischen Darm und Leber zu untersuchen. Die dynamische Flusskontrolle ist entscheidend für die Gewinnung funktioneller Gewebezellen in vitro, insbesondere für den Darm24. Einige OOCs erfordern die Verwendung zusätzlicher Zellkultureinsätze (z. B. Transwell), um zwei oder mehr Zelltypen, die durch eine poröse Membran getrennt sind, gemeinsam zu kultivieren. Aufgrund der Makroskalenreichweite des Mediums können diese Einsätze jedoch nicht für die Mikrofabrikation verwendet werden und verfügen häufig nicht über die Vorteile der Mikrofluidik-Technologie, wie z. B. die Kontrolle über die Strömungsdynamik in der Zellkulturkammer und der zellulären Mikroumgebung. Diese zusätzlichen Einsätze beeinträchtigen häufig die mikroskopische Beobachtung von Zellen, da sie den Arbeitsabstand und die Lichtbeugung durch die Membranporen vergrößern. Polydimethylsiloxan (PDMS) ist aufgrund seiner Biokompatibilität, Transparenz und Elastizität ein weit verbreitetes Material für mikrofluidische Zellkultursysteme. Allerdings muss die PDMS-Absorption verhindert werden, da PDMS die Absorption hydrophober Moleküle verursacht, darunter Metaboliten, Hormone, Arzneimittelkandidaten, Fettsäuren, Lipide und Fluoreszenzindikatoren, die zelluläre Phänotypen und Testergebnisse beeinflussen können. Freie Fettsäuren (FFAs) sind ein entscheidender Faktor bei NAFLD. Obwohl PDMS-basierte mikrofluidische Zellkultursysteme25,26, einschließlich unseres zuvor berichteten In-vitro-GLA-Modells27, die oben genannten Probleme von OOCs für GLA lösen, sind PDMS-basierte Plattformen ohne Behandlungen zur Verhinderung der Absorption hydrophober Moleküle für die Rekapitulation von NAFLD28 nicht anwendbar.

Hier stellen wir eine integrierte Darm-Leber-auf-einem-Chip-Plattform (iGLC) als vereinfachtes menschliches In-vitro-Modell von GLA vor, das dabei helfen kann, tiefere Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen von NAFLD für die Entwicklung neuer Medikamente und Behandlungen zu gewinnen und Diagnosetools. Die iGLA-Plattform29 verfügt über Mikroventile und eine Pumpe, um eine individuelle Zugänglichkeit für jede Zellkulturkammer zu gewährleisten, sowie einen geschlossenen Mediumzirkulationsfluss, um die Darm- und Leberzellen miteinander zu verbinden. Die integrierte Mikropumpe steuert den Perfusionsfluss, um kultivierte Darmzellen zu aktivieren. Die iGLC-Plattform erfordert keine zusätzlichen Zellkultureinsätze und ermöglicht daher eine hochwertige Zellüberwachung zur mikroskopischen Einzelzellprofilierung. Eine einfache Oberflächenbeschichtung mit amphipathischen Molekülen verhindert die Aufnahme von FFAs in PDMS. Wir haben Darm- und Leberzellen mit einem geschlossenen Kreislauf kokultiviert, um die Lebensfähigkeit der iGLC-Plattform als In-vitro-Modell für menschliche GLA zu demonstrieren. Wir haben auch einen NAFLD-ähnlichen Zellzustand induziert, indem wir der Plattform über zwei Zeiträume (1 und 7 Tage) FFAs verabreicht haben, um die anfängliche und fortschreitende NAFLD darzustellen. Schließlich untersuchten wir die einzigartigen zellulären phänotypischen Veränderungen und die damit verbundenen Gennetzwerke für die GLA im NAFLD-ähnlichen Zellzustand durch mikroskopische Einzelzellprofilierung in Kombination mit mRNA-Sequenzierung (mRNA-seq).

Eine konzeptionelle Darstellung der iGLC-Plattform ist in Abb. 1a dargestellt. Das Design der Mikrofluidikplattform ist entscheidend für die Rekapitulation der GLA in vitro. Modelle, die auf Tierversuchen basieren, haben Schwierigkeiten, den Mechanismus der NAFLD-Progression zu untersuchen, da lebende Organe nicht verbunden und getrennt werden können, um vereinfachte Modelle der Multiple-Hit-Theorie zu erstellen. Um die Wechselwirkungen zwischen Geweben aufzuklären, ist eine einzige Plattform erforderlich, die zwei oder mehr Zelltypen innerhalb desselben Formats sowohl mono- als auch co-kultivieren kann. Parallel dazu müssen Kreuzkontaminationen berücksichtigt werden, um die Analyse jedes Zelltyps und des Einflusses anderer Zelltypen zu ermöglichen. Wir haben die iGLC-Plattform so konzipiert, dass sie diese Anforderungen erfüllt (Abb. 1b, c)29. Die iGLC-Plattform besteht aus PDMS mit Gasdurchlässigkeit, Biokompatibilität und Transparenz und besteht aus Perfusions- und Kontrollschichten. Die Perfusionsschicht bestand aus drei Sätzen von zwei Zellkulturkammern (2,1 mm Breite und 220 µm Höhe), die durch mikrofluidische Kanäle (200 µm Breite und 45 µm Höhe) verbunden waren. Die Kontrollschicht verfügte über eine dünne und flexible PDMS-Membran (200 × 200 µm² Fläche und 20 µm Dicke) zur Integration der Mikroventile und der Pumpe, was eine robuste Öffnungs-/Schließsteuerung mit unserer zuvor berichteten Mikrofabrikationstechnologie ermöglichte (ergänzende Abbildung S1)29,30 . Um die Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehreren Arten von Gewebezellen zu untersuchen, ist es notwendig, diese zu isolieren und beliebig zu verbinden. Da die meisten OOCs nicht über integrierte Ventile und Pumpen verfügen, müssen Rohre zwischen mehreren Geräten montiert und demontiert werden, was die Genauigkeit der Kontrolle ihrer Wechselwirkungen verringert, aber unerwünschte Kreuzkontaminationen vermeidet. Die integrierte Mikropumpe ermöglicht eine genauere Kontrolle des perfundierten Flusses als eine externe Pumpe innerhalb des Mikrofluidikgeräts. Darüber hinaus wird der Probenverlust durch zusätzliche Schläuche reduziert. Die PDMS-Membranen an den Mikroventilen und der Pumpe wurden durch einen positiven hydraulischen Druck (150 kPa) betätigt, der von den computergesteuerten Magnetventilen ausgeübt wurde. Die Mikroventile ermöglichen den Zugriff auf einzelne Zellkulturkammern ohne Kreuzkontamination und eine präzise Kontrolle der Proben- oder Reagenzieneinführung. Die integrierte Mikropumpe sorgt für eine geschlossene Medienzirkulation, um Wechselwirkungen zwischen Geweben wie der GLA zu rekapitulieren und die Flussrate innerhalb von 0–20 nL min-1 durch Abstimmung ihres Betätigungszyklus zu regulieren (ergänzende Abbildung S2).

ein Schema für die NAFLD-Progression durch FFAs über die GLA. b Foto einer iGLC-Plattform. Die Perfusions- und Kontrollschichten sind in Rosa bzw. Blau eingefärbt. c Abbildung der für NAFLD verwendeten iGLC-Plattform. Zwei Zellkulturkammern werden für Darmzellen (Caco-2) und Hepatozyten (HepG2) verwendet und sind über einen Mikrofluidikkanal mit einer Mikropumpe verbunden, um eine geschlossene Mediumzirkulation von FFAs zu erreichen. Innerhalb der Mikroventile ist jede Zellkulturkammer einzeln zugänglich, ohne dass die Gefahr einer Kreuzkontamination besteht. Somit ermöglicht dieser Aufbau die Bewertung der Interaktion zwischen Geweben. A–A' zeigt den Querschnitt der Zellkulturkammern für die Caco-2-Darm- und HepG2-Leberzellen. B–B' zeigt die Querschnittsansicht der offenen und geschlossenen integrierten Mikroventile. Aufgrund der elastischen PDMS-Membran wird das normalerweise offene Ventil geschlossen, indem ein höherer Druck auf den Mikrofluidikkanal in der Steuerschicht ausgeübt wird.

Vor der Zellkultur- und FFA-Behandlung haben wir die PDMS-Oberfläche der Zellkulturkammern mit n-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM)31,32 und anschließend Matrigel beschichtet, um die Absorption hydrophober Moleküle (z. B. FFAs und AdipoRed) zu reduzieren fluoreszierender Lipidmarker)33,34 und zur Steigerung der Zelladhäsion und des Zellwachstums (Ergänzende Abbildung S3). Dies ist ein kritisches Problem bei der Verwendung von PDMS-basierten OOCs zur Arzneimittelentwicklung und In-vitro-Krankheitsmodellierung, da niedermolekulare Arzneimittelkandidaten und Lipide vom PDMS absorbiert werden, bevor sie die Zielzellen erreichen, und die Konzentrationen sich von denen in einer Mikrotiterplatte unterscheiden. Unter diesen Bedingungen wären die erzielten Ergebnisse unzuverlässig. DDM ist ein geeignetes amphipathisches Molekül, das die Absorption von PDMS verhindert, da sein hydrophober Teil an die PDMS-Oberfläche bindet und der hydrophile Teil die Absorption hydrophober Moleküle verhindert. Allerdings ist DDM nicht in der Lage, die Zelladhäsion und das Zellwachstum auf der PDMS-Oberfläche zu fördern. Daher haben wir die Kombination von DDM mit einer nachfolgenden Schicht Matrigel in Betracht gezogen. Die DDM/Matrigel-Beschichtung verhinderte teilweise die Absorption des fluoreszierenden Lipidmarkers AdipoRed in das PDMS (ergänzende Abbildung S4). Wir haben auch die verbleibenden FFAs gemessen [eine Mischung aus Palmitinsäure (PA) und Ölsäure (OA) mit einem Molverhältnis von 1:2; siehe Methoden] im Zellkulturmedium nach Inkubation mit dem beschichteten PDMS (Ergänzende Abbildung S5). PA wurde weder vom unbeschichteten noch vom DDM/Matrigel-beschichteten PDMS nach 6-stündiger Inkubation bei 37 °C absorbiert, wohingegen es nach 24-stündiger Inkubation Absorptionen von 53,7 % bzw. 40,9 % aufwies. OA zeigte Absorptionen von 22,0 % bzw. 17,4 % nach 6-stündiger Inkubation und Absorptionen von 67,4 % bzw. 56,7 % nach 24-stündiger Absorption. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die DDM/Matrigel-Beschichtung zwar die Absorption von PA und OA in PDMS nach 24-stündiger Inkubation leicht abschwächte, der Großteil der FFAs jedoch immer noch absorbiert wurde. Daher wurde das Medium während der Experimente alle 6 Stunden ausgetauscht. Allerdings sind weitere Verbesserungen erforderlich, um die PDMS-Absorption zu verhindern, und es sollten andere Strukturmaterialien für OOCs verwendet werden. Dies ist seit langem ein Diskussionsthema in diesem Forschungsfeld17,35.

Um GLA in vitro zu rekapitulieren, wurden Caco-2- und HepG2-Zellen ohne Kreuzkontamination, aber mit geschlossenem Kreislauf in einzelne Zellkulturkammern der iGLC-Plattform eingebracht (Abb. 2a). Um zu bestätigen, dass die iGLC-Plattform eine nachhaltige Zellkultivierung ermöglicht, wurden Caco-2- und HepG2-Zellen 7 Tage lang mit einem mittleren Zirkulationsfluss von 15 nL min−1 kultiviert und mithilfe eines Calcein AM-Fluoreszenzzelllebensfähigkeitsindikators bewertet (Abb. 2b–d und). Ergänzende Daten 1). Obwohl Caco-2-Zellen im Allgemeinen etwa 21 Tage brauchen, um ihre Funktionsfähigkeit zu erlangen, ermöglichen Perfusionsbedingungen, dass Caco-2-Zellen ihre Funktionen innerhalb kürzerer Zeit, beispielsweise 7 Tage, zum Ausdruck bringen36,37. Daher haben wir eine Kultivierungszeit von 7 Tagen gewählt, um GLA in vitro zu rekapitulieren. Zum Vergleich haben wir auch getrennt kultivierte Caco-2- und HepG2-Zellen in Zellkulturkammern bei einer Flussrate von 15 nL/min unter statischen Bedingungen untersucht. Basierend auf rechnergestützter Fluiddynamik (CFD) wurde auf den Zellen eine Flüssigkeitsscherspannung (FSS) von 3,53 × 10 dyn cm erzeugt (ergänzende Abbildung S6). Die Strömungsbedingungen hatten keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der HepG2-Zellen, die bei zirkulierender Strömung eine geringfügige Verbesserung zeigten. Die Caco-2-Zellen zeigten bei zirkulierender Strömung eine höhere Lebensfähigkeit als bei statischen Bedingungen. Die Fluoreszenzintensität von Calcein AM erhöhte sich mit dem zirkulierenden Fluss um etwa das 7,4-fache. Es wurde bereits berichtet, dass Caco-2-Zellen eine verbesserte Funktionalität und Lebensfähigkeit zeigen, wenn sie unter kontinuierlicher Perfusion auf einem Mikrofluidikgerät innerhalb einer Woche nach der Kultur kultiviert werden36,37. Dies beweist, dass die iGLC-Plattform sowohl für Caco-2- als auch für HepG2-Zellen bessere Zirkulationsbedingungen bietet.

a, b Experimentelles Verfahren zur Kultivierung von Caco-2- und HepG2-Zellen in einer iGLC-Plattform (siehe auch ergänzende Methoden). Kurz gesagt: Nachdem ein Mikrofluidikkanal mit einem frischen Zellkulturmedium gewaschen wurde, wurden alle Ventile geschlossen, um eine Luftkontamination in den Chip zu verhindern. Zwei Ventile neben der Zellkulturkammer wurden geöffnet und Zellsuspensionen von Caco-2- und HepG2-Zellen wurden getrennt in die entsprechenden Kammern eingebracht. Nach einem Tag Inkubation bei 37 °C zur Beruhigung der Zellen wurde die Pumpe aktiviert, um das Medium umzuwälzen. Das Zellkulturmedium wurde alle 6 Stunden gewechselt. c Phasenkontrast- (PC) und Fluoreszenzmikroskopaufnahmen von Caco-2- und HepG2-Zellen mit geschlossener Mediumzirkulation in der iGLC-Plattform und gefärbt mit Calcein AM (C_AM) und Hoechst 33258 (Hst). Zum Vergleich untersuchten wir auch einzeln kultivierte Caco-2- (C:C) und HepG2-Zellen (H:H) unter Zirkulationsfluss- (CF) und statischen Bedingungen (S). H:C steht für gemeinsam kultivierte Caco-2- und HepG2-Zellen. Der Maßstabsbalken repräsentiert 100 µm. d Ridgeline-Diagramme, die Einzelzellprofilierung von Caco-2- und HepG2-Zellen zeigen, die mit Calcein AM gefärbt wurden. Zum Vergleich untersuchten wir auch einzeln kultivierte Caco-2- (C:C) und HepG2-Zellen (H:H) unter Zirkulationsfluss- (CF) und statischen Bedingungen (S). H:C steht für gemeinsam kultivierte Caco-2- und HepG2-Zellen. Die p-Werte wurden mit dem Tukey-Kramer-Test geschätzt und sind in der Ergänzungstabelle S1 für Caco-2 und in der Ergänzungstabelle S2 für HepG2-Zellen dargestellt.

Um NAFLD in der iGLC-Plattform zu induzieren, verwendeten wir FFAs, die durch eine Mischung aus PA und OA repräsentiert werden, was typisch für westliche Diäten ist (siehe Methoden)38. Wie in Abb. 2a gezeigt, wurden vor der FFAs-Behandlung Caco-2- und HepG2-Zellen in der iGLC-Plattform mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % (v/v) FBS, kultiviert und dann durch Serum ersetzt -freies DMEM für 12 Stunden, um eine Zellaushungerung zu gewährleisten. Eine Reihe von FFAs-Konzentrationen von 0 bis 2 mM wurden in die iGLC-Plattform eingeführt und die Zellen wurden 24 Stunden lang mit mittlerer Zirkulation inkubiert. Um die Ansammlung von FFAs in den monokultivierten Caco-2- und HepG2-Zellen zu bewerten, wurden die Zellen mit dem Lipidfluoreszenzfarbstoff AdipoRed angefärbt, um die intrazellulären Lipide sichtbar zu machen (Ergänzungsabbildung S7 und Ergänzungstabellen S3 und S4). Sowohl Caco-2- als auch HepG2-Zellen zeigten eine dosisabhängige intrazelluläre FFA-Akkumulation, und für weitere Studien wurde eine Behandlung mit 1 mM FFAs verwendet. Die Ansammlung von Lipidtröpfchen in Hepatozyten ist ein Kennzeichen von NAFLD39 und wurde in unserem Modell beobachtet. Während der FFA-Behandlungen verwendeten wir serumfreies Medium, ergänzt mit 1 % (w/v) BSA, um die Auswirkungen der Zellproliferation zu minimieren. Sowohl monokultivierte Caco-2- als auch HepG2-Zellen zeigten eine Verringerung der Zellproliferation und beeinträchtigten die Zellbehandlung aufgrund von übermäßigem Zellwachstum nicht (ergänzende Abbildung S8). Anschließend untersuchten wir zwei Behandlungsperioden, 1 und 7 Tage, die den Beginn bzw. das Fortschreiten der NAFLD darstellen. Wir haben auch bestätigt, dass die 7-tägige FFA-Behandlung die intrazelluläre Lipidakkumulation in mono- und co-kultivierten Caco-2- und HepG2-Zellen erhöhte (Abb. 3a, b und ergänzende Daten 2). Die co-kultivierten Caco-2-Zellen zeigten eine geringere Lipidansammlung als die monokultivierten Zellen, HepG2-Zellen zeigten jedoch eine erhöhte Lipidansammlung. Wir führten auch eine Annexin-V-Färbung durch, um den Apoptosestatus nach der FFA-Behandlung zu bewerten. Zum Vergleich wurden die Zellen zusätzlich mit 1 µM Staurosporin (STS) behandelt, was die Apoptose induziert. Obwohl berichtet wurde, dass die PA-Akkumulation nach einem Behandlungstag 40,41 Zytotoxizität verursacht, deuteten die Ergebnisse der apoptotischen Färbung (Abb. 4a) gefolgt von der quantitativen Einzelzellprofilierung (Abb. 4b und ergänzende Daten 3) darauf hin, dass die 7-tägigen FFAs Die Behandlung induzierte Apoptose in monokultivierten Caco-2- und HepG2-Zellen, wohingegen eine eintägige Behandlung keine Apoptose induzierte (ergänzende Abbildung S9). Allerdings zeigte die Co-Kultur von Caco-2- und HepG2-Zellen eine Verringerung der Apoptose. Bemerkenswerterweise wurde die Expression von Albumin (ALB), einem funktionellen Hepatozytenmarker, in monokultivierten HepG2-Zellen durch die FFA-Behandlung nicht verändert, co-kultivierte HepG2-Zellen zeigten jedoch eine erhöhte ALB-Expression (Abb. 4c, d und ergänzende Daten 3). Dies deutet darauf hin, dass HepG2-Zellen, die gemeinsam mit Caco-2-Zellen kultiviert wurden, eine verbesserte Funktionalität zeigten.

a Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopaufnahmen von Caco-2- und HepG2-Zellen, die 7 Tage lang mit FFAs (0 und 1 mM) behandelt wurden, gefärbt mit dem Lipid-Fluoreszenzfarbstoff AdipoRed. Die Maßstabsbalken repräsentieren 100 µm. b Ridgeline-Diagramme zur Bewertung der FFA-Akkumulation in einzelnen Zellen [Caco-2 (links) und HepG2 (rechts)] nach 7-tägiger FFA-Behandlung. Die p-Werte wurden mit dem Tukey-Kramer-Test geschätzt und sind in den Ergänzungstabellen S5, S6 für die Caco-2- bzw. HepG2-Zellen dargestellt. Zellen mit einer AdipoRed-Fluoreszenzintensität von über 20 wurden als lipidakkumulierte Zellen betrachtet. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 3).

a Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopaufnahmen von Caco-2- und HepG2-Zellen, behandelt mit FFAs (0 und 1 mM), gefärbt mit dem Marker für apoptotische Zellen Annexin V. Die Maßstabsbalken repräsentieren 100 µm. b Ridgeline-Diagramme zur Bewertung einzelner apoptotischer Zellen (Caco-2 und HepG2) nach 7-tägiger FFA-Behandlung. Zum Vergleich wurden die Zellen 24 Stunden lang mit 1 µM Staurosporin (STS) behandelt. Die p-Werte wurden mit dem Tukey-Kramer-Test geschätzt und sind in den Ergänzungstabellen S7, S8 für die Caco-2- bzw. HepG2-Zellen dargestellt. Zellen mit einer Annexin V-Fluoreszenzintensität von über 0,3 wurden als apoptotische Zellen betrachtet. c Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopaufnahmen von HepG2-Zellen, die mit FFAs (0 und 1 mM) behandelt und mit menschlichem Albumin gefärbt wurden. Die Maßstabsbalken repräsentieren 100 µm. d Ridgeline-Diagramme zur Bewertung einzelner HepG2-Zellen mit menschlicher Albumin-Expression nach 7-tägiger FFA-Behandlung. Die p-Werte wurden mit dem Tukey-Kramer-Test geschätzt und sind in der Ergänzungstabelle S9 für die HepG2-Zellen dargestellt. Zellen mit einer ALB-Fluoreszenzintensität von über 100 wurden als ALB-exprimierende Zellen betrachtet. Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar (n = 3).

Um die zellulären Phänotypen nach der FFA-Behandlung im Detail weiter zu bewerten, haben wir Zellen mit den Fluoreszenzfarbstoffen Calcein AM und Hoechst 33258 gefärbt. Anschließend erfolgte eine High-Content-Analyse (HCA) mit der computergesteuerten Einzelzellanalysesoftware CellProfiler (Abb. 5, Ergänzende Daten 4, Ergänzende Abb. S10, S11)42,43. Im Allgemeinen werden die Farbstoffe Calcein AM und Hoechst 33258 für die Funktion der Zelllebensfähigkeit und als Kernmarker verwendet. Die Calcein-AM-Färbung kann auch zur Bewertung der Zell- und Zellkernmorphologien eingesetzt werden, um zelluläre Parameter für HCA44,45 zu erhalten. Darüber hinaus haben jüngste Fortschritte bei der Einzelzellprofilierung auf der Grundlage von Bildern mit hohem Inhalt, wie z. B. t-verteiltes stochastisches Nachbarembedding (t-SNE), ein quantitatives Verständnis des individuellen Zellstatus mit hochdimensionalen Zellparametern und die Visualisierung dieser Parameter ermöglicht eine zweidimensionale Karte46. Wir analysierten mikroskopische Bilder, um 68 Zellparameter (Ergänzungsdaten 4 und Ergänzungstabelle S10) für jede Zelle von Caco-2- und HepG2-Zellen zu quantifizieren, die 7 Tage lang mit 1 mM FFAs behandelt wurden (Abb. 5a, b und Ergänzungsdaten 4). We identified specific parameters that could be distinguished between non-treated and FFAs-treated cells that are associated with the cellular shape (AreaShape_FormFactor, AreaShape_MeanRadius, and AreaShape_EquivalentDiameter), Calcein AM intensity (Intensity_LowerQuartileIntensity, Intensity_MeanIntensity, and Intensity_MaxIntensity), nucleus shape (Nucleus_AreaShape_FormFactor) und Hoechst 33258 Kernintensität (Intensity_LowerQuaterileIntensity, Intensity_MeanIntensity, Intensity_MaxIntensity und Intensity_MinIntensityEdge). Insbesondere bei den Caco-2-Zellen waren die Zellform (AreaShape_EquivalentDiameter), die Hoechst-Intensität (Intensity_MaxIntensity) und die Calcein-AM-Intensität (Intensity_MaxIntensity) die charakteristischsten Merkmale (Abb. 5a). Das auffälligste Merkmal der HepG2-Zellen war jedoch die Calcein-AM-Intensität (Intensity_MeanIntensity und Intensity_MaxIntensity). Die mit FFAs behandelten HepG2-Zellen zeigten eine Verringerung dieser Merkmale (Abb. 5b). Daher kann HCA auf der Grundlage einer einfachen Zell- und Kernfärbung verwendet werden, um winzige zelluläre phänotypische Veränderungen bei der Behandlung mit FFAs zu identifizieren, die mit molekularen apoptotischen Markern nicht unterschieden werden können. Da für die iGLC-Plattform keine Zellkultureinsätze erforderlich sind, ermöglicht sie die HCA-basierte Einzelzellprofilierung.

a, b Zweidimensionale t-SNE-Diagramme der mikroskopischen Einzelzellprofilierung von gemeinsam kultiviertem Caco-2 (a) und HepG2 (b), behandelt mit 1 mM FFAs oder ohne Behandlung und gefärbt mit Calcein AM-Zellkernen und Hoechst 33258-Kernen Marker (n = 3). Die unterscheidbarsten zellulären Parameter (AreaShape_EquivalentDiameter, Intensity_MaxIntensity_Calcein AM und Intensity_MaxIntensity_Hoechst 33258) werden in den entsprechenden t-SNE-Diagrammen sowie in den Boxplots in der ergänzenden Abbildung S11 angezeigt. Die p-Werte sind in den Ergänzungstabellen S11, S12 dargestellt.

Um die Auswirkungen von FFAs-Behandlungen und Crosstalk durch Co-Kultivierung auf die Genexpression aufzuklären, führten wir eine mRNA-Sequenz und anschließend eine PCA für die differentiell exprimierten Gene (DEGs) durch, die durch eine Varianzanalyse (ANOVA) definiert wurden (Abb. 6a). , b, Ergänzende Abbildungen S12, S13, Ergänzende Daten 5, 6 und Methoden). Wir identifizierten 654 bzw. 1330 Gene in Caco-2- bzw. HepG2-Zellen, die unter den mono- und kokultivierten Bedingungen mit oder ohne Behandlung mit 1 mM FFAs über 7 Tage unterschiedlich exprimiert wurden. In Caco-2-Zellen unterschied die PC1-Achse Mono- und Co-Kulturbedingungen, während die PC2-Achse die FFA-Behandlung unterschied. Bemerkenswerterweise zeigten die Co-Kulturbedingungen einen geringeren Einfluss auf die durch FFA-Behandlungen veränderte Genexpression. Im Gegensatz dazu unterschied die PC1-Achse im Fall von HepG2-Zellen deutlich HepG2-Zellen, die unter Co-Kulturbedingungen mit 1 mM FFAs behandelt wurden, von solchen, die mit anderen Bedingungen behandelt wurden. Die PC2-Achse in PCA von HepG2-Zellen zeigte auch Veränderungen in der Genexpression, die mit der Behandlung mit FFAs verbunden sind; Allerdings reduzierte die Co-Kultivierung die Veränderungen der Genexpression nach der Behandlung mit FFAs.

a, b PCA-Ergebnisse für DEGs, die aus den experimentellen Sätzen Caco-2 (a) und HepG2 (b) erhalten wurden. Die mittleren PC2-Werte unter den Replikaten werden mit gepunkteten Linien angezeigt. Für diese Diagramme wurden der in (a, b) gezeigte Genname und die Änderungsrichtung berücksichtigt. c, d Heatmaps für die DEGs. Z-Werte der Expressionsprofile werden angezeigt.

Die Wärmekarte der K-Mittel-Clusterbildung für DEGs in Caco-2-Zellen zeigte mehrere Cluster mit ähnlichen hochregulierten Genexpressionsmustern unter Co-Kulturbedingungen im Vergleich zu Monokulturbedingungen (Cluster 1, 3, 5 und 10 in Abb. 6c). ). Diese Cluster standen im Zusammenhang mit Zellzyklus und Stoffwechselprozessen, wie aus den Begriffen der Genontologie (GO) hervorgeht (Ergänzende Abbildungen S14, S15). Wir beobachteten auch herunterregulierte Gene, die für die Co-Kulturbedingung in Caco-2-Zellen spezifisch sind (Cluster 2 und 6); Die Anzahl der Gene war jedoch zu gering, um aus der GO-Analyse ausreichende Interpretationen zu erhalten. Im Fall von HepG2-Zellen zeigte Cluster 18 in der Wärmekarte für DEGs einzigartige hochregulierte Gene im Co-Kulturzustand, wohingegen nur Cluster 16 herunterregulierte Gene aufwies, die für den Co-Kulturzustand spezifisch waren (Abb. 6d und ergänzende Abb. S16). , S17).

Anschließend verglichen wir die Auswirkungen der FFA-Behandlung unter Mono- und Kokulturbedingungen auf die Genexpression in Caco-2- und HepG2-Zellen. Die mRNA-seq-Ergebnisse zeigten, dass Caco-2-Zellen eine erhöhte Expression von Genen zeigten, die mit Mitose assoziiert sind (Cluster 8 in Abb. 6a, 7a), wohingegen auf Stress reagierende Gene (Cluster 7 in Abb. 6a, 7a) herunterreguliert waren. Im Gegensatz dazu zeigten mit FFAs behandelte HepG2-Zellen eine erhöhte Expression von Genen im Zusammenhang mit dem Zellzyklus (Cluster 12 und 17 in Abb. 7b)47 und eine Unterdrückung der Expression von Genen im Zusammenhang mit der Zell-Zell-Adhäsion und dem Nukleinsäuretransport (Cluster 15). in Abb. 7b).

a, b Balkendiagramme, die die Genanreicherung im Zusammenhang mit bestimmten GO-Begriffen und -Pfaden für repräsentative K-Means-Cluster von FFAs-behandelten Caco-2- und HepG2-Zellen unter Mono- und Co-Kulturbedingungen zeigen. Die anderen Cluster sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. S14–S17.

Wir haben eine humane iGLC-Plattform eingerichtet, um die GLA-Reaktion auf FFAs in einem NAFLD-Modell zu untersuchen. Obwohl OOCs zur Untersuchung von NAFLD verwendet wurden, bietet die iGLC-Plattform aufgrund der Anwendung der Mikrofabrikationstechnologie mehrere Vorteile. Die Integration der Mikroventile und einer Pumpe in die Plattform ermöglicht den Zugang zu einzelnen Zellkulturkammern ohne unerwünschte Kreuzkontamination und einen geschlossenen Mediumkreislauf zur Nachahmung von menschlichem GLA.

Um die Auswirkungen von FSS auf Zellen zu untersuchen, die durch einen Fluss mit geschlossenem Kreislauf verursacht werden, führten wir eine CFD durch, um den durch den Fluss mit geschlossenem Kreislauf erzeugten FSS abzuschätzen. Das Ergebnis war 3,53 × 10–4 dyn cm–2 (Ergänzende Abbildung S6). Unter diesen Strömungsbedingungen zeigten Caco-2-Zellen eine erhöhte Lebensfähigkeit der Zellen (Abb. 2c), während HepG2-Zellen keine Veränderung zeigten (Abb. 2d). Eine Reihe früherer Berichte deuten darauf hin, dass die Funktionalität von Caco-2-Zellen durch die Anwendung eines Perfusionsflusses mit über 0,0002 dyn cm-2 verbessert werden kann, was dem von uns getesteten FSS-Wert ähnelt48,49,50,51. Darüber hinaus wurde über eine funktionelle Aktivierung durch FSS in HepG2-Zellen berichtet, diese erfordert jedoch einen höheren FSS von über 0,1 dyn cm−2 52,53.

Bemerkenswerterweise veränderten gemeinsam kultivierte HepG2- und Caco-2-Zellen ihre Genexpressionsprofile im Vergleich zu monokultivierten Zellen signifikant (Cluster 1, 3, 5, 10 und 18 in Abb. 6c, d und ergänzende Abb. S14–S17). . Die hochregulierten Gene in Caco-2-Zellen standen im Zusammenhang mit der mitotischen G1-Phase und dem G1/S-Übergang, dem respiratorischen Elektronentransport, der ATP-Synthese durch chemiosmotische Kopplung, der Wärmeerzeugung durch entkoppelnde Proteine, der positiven Regulierung des Spindelkontrollpunkts und katabolen Prozessen kleiner Moleküle. Die meisten davon standen im Zusammenhang mit dem Zellzyklus und Stoffwechselprozessen, die Zellproliferationsanalyse zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen co- und monokultivierten Caco-2-Zellen (ergänzende Abbildung S8). Somit hatte die Genexpression in Caco-2-Zellen, die gemeinsam mit HepG2-Zellen kultiviert wurden, keinen Einfluss auf den Zellzyklus und die Proliferation. Im Gegensatz dazu zeigten hochregulierte Gene von HepG2-Zellen GO-Begriffe für „plasmamembrangebundene Zellprojektionsanordnung“ (Cluster 18 in ergänzender Abbildung S17), und herunterregulierte Gene zeigten „Bewegung auf Mikrotubuli-Basis“ (Cluster 16 in ergänzender Abbildung S17). Ebenso konnten wir keine offensichtlichen zellulären Phänotypen beobachten, die mit Veränderungen der Genexpression verbunden sind.

Um NAFLD-ähnliches GLA in vitro zu rekapitulieren, wurden den Zellen in der iGLC-Plattform FFAs verabreicht (Abb. 2a). Obwohl sowohl in Caco-2- als auch in HepG2-Zellen, die 7 Tage lang mit FFAs behandelt wurden, eine Lipidakkumulation auftrat (Abb. 3a, b), war die Anzahl der apoptotischen Caco-2- und HepG2-Zellen im Co-Kulturzustand im Vergleich zu denen in Mono signifikant verringert -kulturelle Bedingungen.

Im Fall von Caco-2-Zellen hatte die eintägige FFA-Behandlung in keinem der beiden Fälle Einfluss auf den apoptotischen Zellstatus (ergänzende Abbildung S9). Angereicherte GO-Begriffe sind in der ergänzenden Abbildung S13 dargestellt und hängen mit der zellulären Reaktion auf Kupferionen zusammen. Kupfer ist ein essentielles Spurenelement für physiologische Prozesse des Menschen, einschließlich des enzymatischen Stoffwechsels54. Eine Fehlregulation intrazellulärer Kupferionen erzeugt reaktive Sauerstoffspezies (ROS) und ein Stoffwechselungleichgewicht, was zu DNA-Schäden und Apoptose führt55,56,57. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Caco-2-Zellen, die einen Tag lang mit FFAs behandelt wurden, keinen apoptotischen Zellzustand mit Zerstörung der Zellmembran zeigten, sondern aufgrund der Zellreaktion auf Kupferionen DNA-Schäden auslösten. Im Gegensatz dazu zeigten die über einen Zeitraum von 7 Tagen mit FFAs behandelten monokultivierten Caco-2-Zellen einen Anstieg der Anzahl apoptotischer Zellen (22,9 ± 9,9 %), während die mit FFAs über einen Zeitraum von 7 Tagen behandelten Caco-2-Zellen gleichzeitig kultiviert wurden mit HepG2-Zellen hatten schützende Wirkungen gegen Lipid-induzierte Apoptose (8,2 ± 7,2 %), und ähnliche Werte wurden in unbehandelten Caco-2-Zellen beobachtet (monokultiviert, 7,8 ± 2,4 %; co-kultiviert, 10,3 ± 2,2 %). . Obwohl zuvor mit FFAs behandelte Darmzellen Apoptose aufgrund der Lipidansammlung zeigten, gefolgt von einem Anstieg der Mengen an reaktiven Sauerstoffspezies58,59, deutet unser mikroskopisches Einzelzellprofil auf eine Unterdrückung der apoptotischen Signalübertragung hin, was mit den mRNA-seq-Ergebnissen übereinstimmt in Abb. gezeigt. 6a, c und 7a, was auf die Herunterregulierung der „Signalisierung durch Rho-GTPase“ hinweist, des typischen Apoptose-assoziierten Signalwegs60.

Zusätzlich zur Untersuchung des apoptotischen Status von Caco-2-Zellen untersuchten wir auch die Korrelation zwischen phänotypischen Veränderungen in der Zellmorphologie und Genregulationsnetzwerken für In-vitro-GLA im NAFLD-ähnlichen Zustand durch Einzelzellprofilierung (Abb. 5 und Ergänzung). Abb. S10). Zu Beginn der eintägigen FFAs-Behandlung war die Intensität von Hoechst 33258 in nicht behandelten Caco-2-Zellen geringfügig höher als in mit FFAs behandelten Caco-2-Zellen (Ergänzende Abbildungen S10), jedoch im Progressionsstadium nach 7 Tagen Bei der Behandlung mit FFAs zeigte die Intensität des Hoechst 33258 das gegenteilige Ergebnis, wobei mit FFAs behandelte Caco-2-Zellen eine höhere Intensität zeigten als die nicht behandelten Caco-2-Zellen (Abb. 5). Im Allgemeinen kann die zelluläre Aufnahme von Hoechst 33258 entweder durch ABC-Transporter oder durch Diffusion über eine beschädigte Zellmembran erfolgen. Die mRNA-seq-Ergebnisse für Caco-2-Zellen, die 1 oder 7 Tage lang mit FFAs behandelt wurden (Ergänzende Abbildungen S13 – S15), zeigten keine angereicherten GO-Begriffe im Zusammenhang mit Transportern (z. B. ATP-bindender Kassettentransporter ABCG2)61, die ausströmen könnten Hoechst 33258 außerhalb der Zellen. Somit hatten die Transporter keinen Einfluss auf die Intensität von Hoechst 33258. Daher könnte die Behandlung mit FFAs die Zellmembran schädigen, was zu einem Anstieg der Hoechst 33258-Intensität, aber nicht zur Induktion von Apoptose führen würde.

Im Gegensatz dazu wiesen mit FFAs behandelte HepG2-Zellen die am stärksten unterscheidbaren Merkmale auf, wie z. B. die Calcein-AM-Intensität (Intensity_MeanIntensity und Intensity_MaxIntensity), und mit FFAs behandelte HepG2-Zellen zeigten eine Verringerung dieser Merkmale (Abb. 5b). Wenn man bedenkt, dass die Intensität von Calcein AM die Lebensfähigkeit der Zellen darstellt62, legt dieses Ergebnis nahe, dass FFAs die Lebensfähigkeit kokultivierter HepG2-Zellen verringern. Im Gegensatz dazu beobachteten wir unter Co-Kulturbedingungen keinen Anstieg apoptotischer HepG2-Zellen, wie durch Annexin V-Färbung bestätigt (Abb. 4a, b). Bemerkenswerterweise zeigten die mRNA-seq-Ergebnisse, dass mit Caco-2-Zellen kokultivierte HepG2-Zellen eine erhöhte Genexpression im Zusammenhang mit dem Zellzyklus zeigten (Cluster 12 und 17 in Abb. 7b). Darüber hinaus war die Expression von Genen, die mit der Zell-Zell-Adhäsion assoziiert sind, in FFAs-behandelten HepG2-Zellen unter Co-Kulturbedingungen verringert (Cluster 15 in Abb. 7b). Diese Ergebnisse legen nahe, dass HepG2-Zellen von differenzierten Leberzellen in proliferierende Zellen umgewandelt werden, da die Behandlung mit FFAs eine leichte Schädigung in HepG2-Zellen verursacht, die gemeinsam mit Caco-2-Zellen kultiviert wurden. Zellzyklen und Zellteilung sind für die Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase von entscheidender Bedeutung, aber bei Krankheiten wie NAFLD verdeutlichen sie häufig das Ungleichgewicht des Zellzyklus, das durch gestörte Stoffwechselsignale verursacht wird47. Insgesamt deuten die Ergebnisse unserer Plattform darauf hin, dass mit Caco-2-Zellen kokultivierte HepG2-Zellen durch FFAs-Behandlung für NAFLD-ähnliche Genexpressionsnetzwerke aktiviert wurden.

Für die Entwicklung eines fortschrittlichen In-vitro-NAFLD-Modells sind die verwendeten Zelltypen von entscheidender Bedeutung. In dieser Studie wurden die menschliche hepatozelluläre Karzinom-Zelllinie HepG2 und die menschliche kolorektale Adenokarzinom-Zelllinie Caco-2 verwendet, da sie unsterblich gemacht und bisher weit verbreitet waren. Allerdings weisen solche Zelllinien genetische Mutationen auf und können keine ordnungsgemäßen Funktionen als tatsächliche Hepatozyten63 und Darmzellen64 ausüben. Im Fall von Hepatozyten wurde die humane hepatozelluläre Karzinomzelllinie HepaRG aufgrund ihrer relativ höheren Funktionalitäten als die von HepG2-Zellen in letzter Zeit für die Modellierung von Lebererkrankungen sowie für toxikologische Forschungen verwendet, aber HepaRG-Zellen zeigten auch Unterschiede im Lipidstoffwechsel65. Darüber hinaus bilden Zelllinien im Allgemeinen eine reine Zellpopulation und können die zelluläre Vielfalt nicht repräsentieren. Beispielsweise enthält die Leber Hepatozyten und nicht-parenchymale Zellen (NPCs) wie Kupffer-Zellen, Endothelzellen und Sternzellen. Insbesondere da berichtet wurde, dass das mikrophysiologische System der Leber (L-MPSs) Lebersteatose mithilfe von NPCs rekapituliert66, werden NPCs mittlerweile für ihre Bedeutung bei der Modellierung von Lebererkrankungen anerkannt. Im Gegensatz dazu zeigten von NAFLD-Patienten gewonnene Primärzellen eine ähnliche Zellvielfalt und metabolische Reaktionen auf Arzneimittel67. Primärzellen verfügen jedoch nur über eine begrenzte Fähigkeit zum Zellwachstum und verlieren in vitro häufig ihre Funktionen. Darüber hinaus ist es schwierig, gesunde Spender zu identifizieren, um eine Kontrollprobe zu erhalten. Zusätzlich zu Primärzellen können humane pluripotente Stammzellen (hPSCs), wie embryonale68 und induzierte pluripotente Stammzellen69,70,71, nach Induktion der Differenzierung durch Anwendung von Wachstumsfaktoren und Nährstoffen mehrere Zelltypen aus einer Einzelzellquelle bereitstellen. Die jüngsten Fortschritte bei Gen-Editing-Technologien wie CRISPR/Cas-Systemen72 ermöglichen die Erstellung genmodifizierter hPSCs zur Modellierung von Krankheiten, für die die Primärzellen nicht geeignet sind. Die von hPSCs abgeleiteten Gewebezellen konnten jedoch nicht die gesamte Zellvielfalt vollständig abdecken und ihre Funktionalität in vivo nicht zum Ausdruck bringen. Daher bleibt es für hPSCs weiterhin eine Herausforderung, die pathologischen Bedingungen von NAFLD in vitro vollständig zu rekapitulieren. Obwohl in dieser Studie Leber- und Darmzelllinien zur Rekapitulation von GLA und NALFD verwendet wurden, konnten sie bei der Behandlung mit FFAs neue Einblicke in NAFLD-ähnliche Genexpressionsnetzwerke liefern. Unter Verwendung von Primärzellen oder von hPSC abgeleiteten Hepatozyten/Darmzellen mit höherer Funktionalität und zellulärer Diversität wird die iGLC-Plattform die Reproduktion der idealen Ergebnisse der In-vivo-NAFLD-Initiierung und -Progression ermöglichen.

Darüber hinaus ist NAFLD, wie in dieser Studie gezeigt, an Organ-zu-Organ-Interaktionen beteiligt. Jüngste Berichte deuten darauf hin, dass die Darmmikrobiota die NAFLD-Entwicklung erheblich beeinflusst und bei der Etablierung eines neuen NAFLD-Modells berücksichtigt werden muss9,10,11. Allerdings benötigt jedes Organ häufig optimale Kulturbedingungen, um seine ordnungsgemäßen Funktionen auszudrücken. Unsere aktuelle iGLC-Plattform kann nur dasselbe Zellkulturmedium verwenden, um zwei verschiedene Gewebe miteinander zu verbinden. Daher muss die nächste Generation von iGLC-Plattformen diese Probleme überwinden. Kürzlich haben wir berichtet, dass das mehrschichtige GLA-MPS27,73 sowohl eine individuelle Zugänglichkeit für jedes Gewebe als auch eine geschlossene Medienzirkulation ermöglicht, um entzündliche Darmerkrankungen zu rekapitulieren, indem Darmzellen mit einem Entzündungsauslöser (z. B. Lipopolysaccharid) behandelt werden. Das mehrschichtige GLA-MPS-Gerät bestand jedoch aus PDMS und war ohne Oberflächenbehandlung gegen molekulare Absorption, wie z. B. FFAs, nicht für die Modellierung von NAFLD geeignet28. Wie in der ergänzenden Abbildung S5 gezeigt, kann das mehrschichtige GLA-MPS mit der PDMS-Oberflächenbeschichtung, da die Oberflächenbeschichtung für PDMS die Absorption von FFAs verringerte, als Plattform für die Untersuchung der NAFLD-Initiierung und -Progression durch Behandlung von Zellen mit FFAs in a dienen quantitativer und robuster Mode.

Stattdessen ist es auch wertvoll, alternative Materialien zu PDMS zu finden, um die bekannten Probleme von PDMS zu vermeiden74,75. Thermoplastische Materialien (z. B. Polystyrol, Polymethylmethacrylat, Polypropylen und Cycloolefin-Polymere) könnten für die Herstellung von OOCs und die Massenproduktion geeignet sein, es ist jedoch aufgrund ihrer Eigenschaften schwierig, Membranen zum Betätigen von Mikroventilen/Pumpen oder zum Strecken kultivierter Zellen76,77 zu verformen Steifigkeit. Perfluorpolyether-Elastomere wurden kürzlich zur Herstellung von OOCs verwendet, um die Absorption hydrophober Moleküle zu verhindern78,79. Obwohl Perfluorpolyether-Elastomere für die Modellierung von NAFLD in vitro attraktiv sein könnten, stellen solche elastischen Materialien immer noch eine Herausforderung für die Massenproduktion für industrielle Anwendungen dar. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, die optimalen Materialien für die Herstellung von OOCs auszuwählen, um die Anforderungen der gezielten Studien und Anwendungen zu erfüllen und genauere Ergebnisse zur Darstellung menschlicher pathophysiologischer Zustände zu erhalten80.

Zusammenfassend stellt die iGLC-Plattform ein neues menschliches In-vitro-Modell zur Rekapitulation physiologischer und NAFLD-pathologischer Zustände mit Schwerpunkt auf GLA dar. In naher Zukunft könnte die iGLC-Plattform in Kombination mit HCA und dem Omics-Ansatz tiefere Einblicke in die NAFLD-Entwicklung für die Etablierung neuer Medikamente liefern. Die iGLC-Plattform kann zur Entwicklung von Medikamenten für NAFLD sowie für eine Vielzahl von mit GLA81 verbundenen Erkrankungen beitragen, wie z. B. entzündliche Darmerkrankungen, für die es keine In-vitro-Versuchsumgebungen gibt.

Die iGLC-Plattform wurde aus einem flexiblen PDMS-Polymer (SYLGARD 184, Dow Corning) unter Verwendung einer mehrschichtigen Soft-Lithographie-Replika-Formtechnik hergestellt, wie bereits berichtet (ergänzende Abbildung S1)82,83. Kurz gesagt bestand die Kontrollschicht aus Mikrokanälen, die hydraulischen Druck lieferten und aus einer 30 µm dicken Negativ-Fotolackform (TMMR S2000, Tokyo Ohka Kogyo) gegossen und mit einem Standard-Fotolithografiegerät strukturiert wurden. Die Perfusionsschicht besteht aus zwei Zellkulturkammern (225 µm Höhe und 2,1 mm Breite), die durch halbelliptische Mikrokanäle (45 µm Höhe und 200 µm Breite) miteinander verbunden sind. Der Formherstellungsprozess für die Perfusionsschicht folgte dem Prinzip der Mehrschichtlithographie, das Standardfotolithographie (Zellkulturkammern) und Graustufenlithographie (Mikrokanäle) kombiniert. Zunächst wurde eine negative Resistschicht (TMMF S2045, Tokyo Ohka Kogyo) mit einer Dicke von 180 µm auf einem Siliziumwafer strukturiert. Als nächstes wurde ein positiver Resist (PMER P-LA900PM, Tokyo Ohka Kogyo) mit einer Dicke von 45 µm auf den Wafer aufgeschleudert. Anschließend wurde eine auf digitalen Mikrospiegelgeräten (DMD) basierende Graustufenlithographie (DL-1000GS/KCH, NanoSystem Solutions) unter Verwendung numerisch optimierter Maskendaten82 durchgeführt, um eine präzise Formherstellung auf Waferebene zu erreichen. Dies ermöglichte eine vollständige Abdichtung der Mikrokanäle mit Mikroventilen und einen hocheffizienten Antrieb des peristaltischen Mikropumpsystems. Nach der Formherstellung wurden die PDMS-Basis und der Härter gründlich in einem Gewichtsverhältnis von 10:1 gemischt. Für die Kontrollschicht wurde die PDMS-Mischung mit einer Dicke von 50 µm auf die Form aufgeschleudert, um eine kontrollierte PDMS-Dicke von 20 µm im Membranbereich zu erhalten. Das PDMS für die Kontroll- und Perfusionsschichten wurde auf einer Heizplatte bei 80 °C für 4 Minuten bzw. in einem Konvektionsofen bei 80 °C für 40 Minuten ausgehärtet. Anschließend wurde die Perfusionsschicht abgezogen, präzise ausgerichtet und mithilfe einer partiellen PDMS-Härtungsmethode mit der Kontrollschicht verbunden. Die zusammengebaute Struktur wurde 2 Stunden lang in einen Ofen bei 80 °C gestellt und dann vom Siliziumwafer abgezogen. Abschließend wurden die Zulauf- und Ablaufbrunnen geöffnet. Das zusammengebaute Gerät wurde mit O2-Plasma (FA-1, SAMCO) dauerhaft auf einem mikroskopischen Objektträgerglas (25 mm × 75 mm) befestigt.

Die Mikroventile und die Mikropumpe wurden durch positiven hydraulischen Druck über verbundene Steuerkanäle betätigt. Der Kontrollkanal im Chip wurde zunächst mit einer 1-ml-Spritze mit destilliertem Wasser gefüllt, um eine Gaspermeation durch das PDMS zu verhindern. Anschließend wurden Metallstifte und Teflonschläuche (Pilot Corporation) verwendet, um die Einlassschächte der Steuerkanäle und des Pneumatiksystems mit einer komprimierten Stickstoffgasquelle (geregelt auf 0–200 kPa) zu verbinden. Die Druckbetätigung und -freigabe der Ventile wurde mit der LabVIEW-Software (Version 11.0, National Instruments) über Magnetventile (Microfluidic System Works Inc. und LEE Company) unter Verwendung einer Controller-Karte (VC3 8-Controller [ALA Scientific Instruments] und NI) gesteuert und betrieben USB-6501 [National Instruments]). Die Mikropumpe besteht aus drei benachbarten Mikroventilen mit sequentieller Betätigung, um eine periodische peristaltische Bewegung zu ermöglichen und so einen Medium-Rezirkulationsfluss im Chip zu erzeugen.

HepG2-Zelllinien für menschliches hepatozelluläres Karzinom und Caco-2 menschliches kolorektales Adenokarzinom wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gehalten, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum (FBS, Cell Culture Bioscience), 1 % (v/v). ) nichtessentielle Aminosäuren (Thermo Fisher Scientific) und 1 % (v/v) Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher Scientific) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % (v/v) CO2. HepG2- und Caco-2-Zellen wurden alle 3 und 5 Tage mit Trypsin/EDTA-Lösung (0,04 %/0,03 % [v/v]) und im Verhältnis 1:5 bzw. 1:10 passagiert.

Um sicherzustellen, dass in Zellproben keine Mykoplasmenkontamination vorliegt, wurde ein Mykoplasmen-Nachweistest unter Verwendung des MycoAlert™ Mykoplasmen-Nachweiskits (Lonza, LT07-118) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Positiv- und Negativkontrollen wurden in jeden Testlauf einbezogen, um die Genauigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Durch Messung der Lumineszenz vor (Ablesung A) und nach der Zugabe des MycoAlert™-Substrats (Ablesung B) wurde ein Verhältnis verwendet, um das Vorhandensein oder Fehlen von Mykoplasmen zu identifizieren. Die HepG2- und Caco-2-Zellen haben ein B/A-Verhältnis von 0,7 bzw. 0,3. Im Vergleich zur Negativkontrolle 0,4 und der Positivkontrolle 18,6 wurde dann bestätigt, dass die Zellproben (<0,9) keine Mykoplasmenkontamination enthielten.

Vor der Zellaussaat wurde die Plattform durch Waschen mit 70 % Ethanol sterilisiert und 30 Minuten lang unter ultraviolettem Licht in eine Biosicherheitswerkbank gestellt. Anschließend wurden die Zellkulturkammern 24 Stunden lang bei 4 °C mit 0,1 % (Gew./Vol.) DDM (n-Dodecyl-β-D-Maltosid) in PBS beschichtet und dann mit Matrigel hESC-qualifizierter Matrix (Corning) verdünnt auf beschichtet 1,3 % (v/v) in DMEM/F12 (Sigma-Aldrich) bei 4 °C für 24 h (Ergänzende Abbildung S3). Nachdem das überschüssige Matrigel mit DMEM abgespült wurde, wurde der Chip bis zur Verwendung in einen Inkubator bei 37 °C gestellt.

HepG2- und Caco-2-Zellen wurden aus den Kulturflaschen mit 1 ml Trypsin/EDTA-Lösung (0,04 %/0,03 % [v/v]) geerntet und 5 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in frischem Zellkulturmedium bei 1,0 × 106 Zellen ml−1 resuspendiert. Die Mikroventile neben den Zellkulturkammern wurden geschlossen, um eine Kreuzkontamination während der Zellaussaat zu verhindern. Anschließend wurden 5 µL der Caco-2-Zellsuspension mit einer Pipette in die Vertiefung neben der Zellkulturkammer bei 7,0 × 104 Zellen cm−2 eingebracht. HepG2-Zellsuspension (5 µL) wurde in eine andere Zellkulturkammer gegeben. Die Plattform wurde in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % (v/v) CO2 gestellt. Nach einem Tag wurde das Zellkulturmedium gewechselt, um schwimmende tote Zellen zu entfernen. Das Zellkulturmedium wurde alle 6 Stunden unter der Kontrolle unserer benutzerdefinierten LabVIEW-basierten Software gewechselt.

Die FFA-Behandlungslösungen waren eine Mischung aus PA (Sigma-Aldrich) und OA (Sigma-Aldrich) in einem Molverhältnis von 1:2. Zur Herstellung der Behandlungslösungen wurde PA in Dimethylsulfoxid (DMSO; Nacalai Tesque Inc.) bei 20 mg mL−1 gelöst, um als PA-Stammlösung (78 mM) zu dienen. OA wurde in DMSO bei 100 mg mL−1 gelöst, um als OA-Stammlösung (354 mM) zu dienen. PA- und OA-Stammlösungen wurden in DMEM (enthaltend 1 % fettsäurefreies BSA, 1 % P/S und 1 mM nichtessentielle Aminosäuren) gemischt (PA:OA = 1:2), um eine Reihe von FFAs-Konzentrationen (0,1 %) zu erzeugen , 0,2, 0,5, 1 und 2 mM). Vor der FFA-Behandlung wurden beide Zellkulturkammern für 12 Stunden Zellmangel durch serumfreies DMEM ersetzt. Anschließend wurde FFAs-haltiges Medium in die Zellkulturkammer eingebracht. Die Plattform wurde 7 Tage lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator inkubiert und das Medium alle 6 Stunden ausgetauscht.

Zur Färbung lebensfähiger bzw. apoptotischer Zellen wurden die Farbstoffe Calcein AM (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) und Annexin V-Alexa Fluor® 647 (BioLegend) verwendet. Hoechst 33258 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) wurde zum Färben der Kerne verwendet. Die Färbelösung wurde durch Mischen von 10 µL Hoechst 33258 (1 mg mL-1 Stammkonzentration), 10 µL Calcein AM (1 mg mL-1 Stammkonzentration), 10 µL Annexin V (50 µg mL-1 Stammkonzentration) und 500 hergestellt µL Annexin V-Bindungspuffer (BioLegend) und 500 µL DMEM. Der Waschpuffer bestand aus 500 µL Annexin V-Bindungspuffer und 500 µL DMEM. Nach der Behandlung wurden die Zellen zweimal mit frischem DMEM gewaschen und 10 µL Färbelösung mit einer Pipette über den angrenzenden Einlass in eine Zellkulturkammer eingebracht. Anschließend wurden die Zellen 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Überschüssige Färbelösung wurde durch dreimaliges Waschen mit 30 µL Waschpuffer entfernt.

Die Lipidakkumulation wurde mithilfe des AdipoRed-Assays (Lonza) gemäß dem Protokoll des Herstellers sichtbar gemacht. Kurz gesagt, 15 µL AdipoRed-Testreagenz und 10 µL Hoechst 33258 wurden mit 1 ml DMEM gemischt, um die AdipoRed-Färbelösung herzustellen. Die Zellkulturkammern und -kanäle wurden zweimal mit PBS gewaschen. AdipoRed-Färbelösung (10 µL) wurde zugegeben und 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Kammern wurden dreimal mit frischer DMEM-Lösung gewaschen.

Die Zellen in den Zellkulturkammern wurden mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd (PFA, FUJIFILM Wako Pure Chemical) in PBS fixiert und 30 Minuten lang mit 0,1 % (v/v) Triton X-100 in PBS permeabilisiert. Die Zellen wurden dann in Blockierungspuffer inkubiert, der 5 % normales Ziegenserum (Vector), 5 % normales Eselserum (Wako), 3 % BSA (Sigma-Aldrich) und 0,1 % Tween-20 (Nacalai Tesque, Inc.) enthielt PBS bei 4 °C für 24 h. Nach der Blockierung wurden die Zellen 24 Stunden lang mit Maus-Anti-Human-Albumin-IgG (Stammlösung 10 µg mL-1, verdünnt mit Blockierungspuffer auf 20 ng mL-1, Thermo Fisher Scientific) als primärem Antikörper in der Blockierungslösung behandelt. Am folgenden Tag wurden die Zellen nach dreimaligem Waschen der überschüssigen Antikörper mit PBS (enthaltend 0,1 % Tween-20) mit Alexa Fluor 647-markiertem Esel-Anti-Maus-IgG H&L (Stammlösung 1 µg mL−1, verdünnt um 0,1) behandelt % Tween-20 PBS in 1 ng mL−1, Jackson ImmunoResearch) bei 25 °C für 1 Stunde. Die Zellkerne wurden mit 50 µl einer Lösung von 300 nM 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, Dojindo Laboratories) 30 Minuten lang bei 25 °C angefärbt und dann zweimal mit PBS gewaschen.

Die Chips wurden auf dem Tisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops Nikon ECLIPSE Ti platziert, das mit einer CFI-Plan-Fluor-Objektivlinse mit 10×/0,30 NA (Nikon, Tokio, Japan) und einer CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) (ORCA) ausgestattet war. R2; Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan), Quecksilberlampe (Intensilight; Nikon), automatischer XYZ-Tisch (motorisierter Ti-S-ER-Tisch mit Encodern; Nikon) und Filterwürfel für die Fluoreszenzkanäle (DAPI und GFP HYQ; Nikon). ). Für die Bildaufnahme wurden die Belichtungszeiten auf 100 ms für (DAPI) Hoechst 33258, 5 ms für (GFP HYQ) Calcein AM, 2 s für (TRITC) Annexin V und 100 ms für den (TRITC) AdipoRed-Assay eingestellt.

Zunächst wurden 3 µL des Zellkulturmediums von einem Chip gesammelt und mit 96,95 µL der Arbeitslösung (50 % Isopropanol, 25 % Acetonitril und 25 % Wasser) und 0,05 µL der internen Standardlösung (PA-d4: 5 mM, OA-d9:5 mM, in Isopropanol). Die Mischung wurde 30 Sekunden lang kräftig gemischt und 10 Minuten lang bei 4 ° C und 16.000 × g zentrifugiert. Anschließend wurden 2 µL des Überstands injiziert und auf einem Nexera UHPLC-System (Shimadzu, Kyoto, Japan) unter Verwendung eines binären Gradienten mit Lösungsmittel A (50 % Acetonitril, 18 % Isopropanol und 32 % Wasser) und Lösungsmittel B (90 % Isopropanol) aufgetrennt , 10 % Acetonitril, 10 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure). Das Gradientenprogramm war wie folgt: 0 % B für 14 Minuten, 100 % B für 3 Minuten und 0 % B für 3 Minuten. Eine ACQUITY UPLC BEH C18-Säule (130 Å, 1,7 µm, 2,1 mm × 100 mm (Waters, Milford, MA)) wurde bei 40 °C verwendet. Die UHPLC-Eluate wurden online in den LC-MS 8030plus (Shimadzu) infundiert, der auf den negativen Elektrospray-Ionisationsmodus (ESI-Modus) eingestellt war. Die PA- und OA-Reaktionen wurden durch Pseudomultiple-Reaction-Monitoring (pMRM) mit Übergängen bei m/z 255,05 > 255,35 bzw. 281,05 > 281,45 beobachtet. Die pMRM-Übergänge für PA-d4 und OA-d9 betrugen 258,95 > 259,45 bzw. 290,10 > 290,40. Die pMRM-Übergänge wurden optimiert und die Peakflächen wurden mit der LabSolutions-Software (Shimadzu) berechnet. Die PA- und OA-Reaktionen wurden für jede Probe auf die von PA-d4 und OA-d9 normalisiert. Alle Messungen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt und die durchschnittlichen Antworten wurden verwendet. Standardkurven wurden durch Messung von leerem Kulturmedium, ergänzt mit steigenden Mengen an PA und OA, erstellt.

Die RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) aus den Zellen gereinigt. Die Mikroventile waren zunächst geschlossen, um eine Kreuzkontamination zwischen den HepG2- und Caco-2-Zellen zu verhindern. Nachdem die Zellen mit PBS gewaschen wurden, wurden 10 µL Trypsin/EDTA-Lösung (0,04 % / 0,03 % [v/v]) in die Zellkulturkammern gegeben und 10 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit einer 10-µL-Pipette geerntet und in 1,5-ml-Röhrchen gegeben. Die Zellen wurden lysiert, indem 350 µL Lysepuffer aus dem Kit und 350 µL 70 % (v/v) Ethanol in die Röhrchen gegeben wurden. Jede Lösung wurde auf eine RNeasy Mini-Spin-Säule übertragen, die in einem 2-ml-Sammelröhrchen platziert war. Die Säule wurde 15 s lang bei 8000 × g zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Als nächstes wurden 350 µL Puffer RW1 zu den Säulen gegeben und zentrifugiert. Anschließend wurden 80 µL DNase-Verdauungspuffer zur Säule gegeben und 15 Minuten bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurden 350 µL Puffer RW1 in das Säulenröhrchen gegeben und erneut zentrifugiert. Die Säule wurde zweimal mit 500 µL Puffer RPE gewaschen, in ein neues 2-ml-Röhrchen gegeben und zentrifugiert. Anschließend wurde die Säule in ein neues 1,5-ml-Sammelröhrchen gegeben und 30 µL RNase-freies Wasser zur Säule gegeben. Anschließend erfolgte eine 1-minütige Zentrifugation bei 8000 × g, um die RNA in das Sammelröhrchen zu eluieren. Die RNA-Qualität wurde mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies Inc., USA) bewertet.

mRNA-seq wurde von Takara Bio Inc. oder Oxford NANOPORE Technologies durchgeführt. Für Takara Bio Inc. wurden, kurz gesagt, 50 ng Gesamt-RNA aus jeder Probe amplifiziert und unter Verwendung von SMART-seq (SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit, Takara Bio) zu cDNA synthetisiert. Die cDNA wurde verwendet, um mit dem Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina) eine Bibliothek zu erstellen, und die cDNA-Bibliothek wurde mit NovaSeq 6000 (Illumina) sequenziert. Für Oxford NANOPORE Technologies wurden 40 ng Gesamt-RNA mit 9 μl RNase-freiem Wasser verdünnt, mit VN-Primer (Oxford NANOPORE Technologies, UK) und 1 μl 10 mM dNTPs (New England Biolabs Inc., Ipswich, Massachusetts, USA) gemischt. USA) und 5 Minuten bei 65 °C inkubiert, um die cDNA-Bibliothek vorzubereiten. Separat wurden 4 μL 5x RT-Puffer (Thermo Fisher Scientific), 1 μL RNaseOUT (Thermo Fisher Scientific), 1 μL nukleasefreies Wasser und 2 μL Strand-Switching Primer (Oxford NANOPORE Technologies) als Strang gemischt -Schaltpuffer. Die beiden Lösungen wurden 2 Minuten lang bei 42 °C gemischt und dann 1 μl Maxima H Minus Reverse Transkriptase (Thermo Fisher Scientific) hinzugefügt. Die Mischung wurde 90 Minuten lang bei 42 °C und 5 Minuten lang bei 85 °C inkubiert und bis zur Verwendung als cDNA-Bibliothek bei 4 °C gelagert. Genau 5 μl Aliquot der cDNA-Bibliothekslösung wurden mit 25 μl 2x LongAmp Taq Master Mix (New England Biolabs Inc.), 1,5 μl Barcode Primers (Oxford NANOPORE Technologies) und 18,5 μl nukleasefreiem Wasser gemischt. Eine PCR wurde durchgeführt (95 °C für 30 s; 18 Zyklen von 95 °C für 15 s, 62 °C für 15 s, 65 °C für 50 s und 65 °C für 6 min), um die cDNA für das Multiplexen mit einem Barcode zu versehen. Die PCR-Produkte wurden bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Anschließend wurde 1 μl NEB-Exonuklease 1 (New England Biolabs Inc.) zugegeben, bevor 15 Minuten lang bei 37 °C und anschließend 15 Minuten lang bei 80 °C inkubiert wurde. Amplifizierte DNA wurde gereinigt und in 12 μl Elutionspuffer (Oxford NANOPORE Technologies) unter Verwendung von Agencourt AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN, USA) gesammelt. Ein BioAnalyzer 2100 mit einem High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies) wurde verwendet, um die Menge und Qualität der barcodierten cDNA zu bewerten. Als nächstes wurden 50 fmol barcodierte cDNA mit 1 μl Rapid Adapter inkubiert, um ein Gesamtvolumen von 11 μl zu erreichen, und dies wurde 5 Minuten lang bei 25 °C inkubiert. Für die Nanoporensequenzierung wurden 12 μl der vorbereiteten DNA-Bibliothek mit 37,5 μl Sequenzierungspuffer (Oxford NANOPORE Technologies) und 25,5 μl Ladepuffer (Oxford NANOPORE Technologies) gemischt. Diese Lösung wurde in eine Nanopore-Durchflusszelle (v9.4.1) gegeben und ein Sequenzierungslauf für 24 Stunden durchgeführt.

Ursprünglich wurden mRNA-seq-Reads mit BowTie (v.2.1.0)84 auf die rRNA-, tRNA- oder mitochondrialen Genomsequenzen abgebildet. Die zugeordneten Lesevorgänge wurden verworfen und nicht für die folgende Analyse verwendet. Die verbleibenden Lesevorgänge wurden mit STAR Aligner (2.7.1a)85 unter Verwendung von ENCODE-Optionen unter Berücksichtigung der Genannotation und Ensembl (ver.98)86 auf das menschliche Genom (GRCh38) abgebildet. Nach der Zuordnung zum Genom wurden die Genexpressionswerte (Transcripts Per Million Reads; TPM) mit RSEM (Version 1.3.0)87 berechnet. Die DEGs der monokultivierten und kokultivierten Proben wurden mit DEseq2 (Version 1.8.2)88 berechnet. Wenn ein Gen die folgenden Kriterien erfüllte, wurde es als DEG definiert: p < 0,01, abs (log2(Fold Change)) ≥ 0,263, Basismittelwert der Rohablesungen ≥ 31 und durchschnittliches TPM in jeder Probe ≥ 1. GO-Analyse von DEGs wurde mit dem WEB-basierten Gene Set Analysis Toolkit (WebGestalt89) durchgeführt. Für die Datenbank wurde „Biological Process noRedundant“ ausgewählt, und für den Referenzsatz wurden „Genomprotein-kodierende“ Gene ausgewählt. Als Inputs wurden proteinkodierende Gene unter den DEGs verwendet.

Um die Behandlungsbedingungen für FFAs zu berücksichtigen, verwendeten wir ANOVA, um DEGs auszuwählen und die Proben zu charakterisieren. Ein Gen wurde als DEG behandelt, wenn p < 0,05 und abs(log2(Fold Change)) ≥ 0,263 für eine Kombination aus zwei beliebigen Proben. Die Expressionswerte des DEG wurden für PCA zur Charakterisierung der Proben verwendet. Um DEG-Sets mit FFAs-minus und FFAs-plus unter Monokulturbedingungen, FFAs-minus und FFAs-plus unter den Co-Kulturbedingungen und mono- und cokultivierten Proben unter den FFAs-minus-Bedingungen zu vergleichen, wurden DEGs mit a Es wurde eine PC2-Beladung von ≥2 oder ≤0,5 verwendet. Die Ergebnisse wurden verwendet, um Veränderungen in der Genexpression im Zusammenhang mit der Behandlung mit FFAs zu bewerten. Um Genexpressionsprofile entsprechend der FFA-Behandlung unter Mono- und Co-Kulturbedingungen zu vergleichen, verwendeten wir die Gene Set Enrichment Analysis (GSEA90, Version 4.0.4) mit DB-Dateien (msigdb.v7.1.symbols.gmt). Als Inputs wurden die Fold-Change-Werte für proteinkodierende Gene verwendet. Die Balkendiagramme zeigen FDR-q-Werte für die vier wichtigsten Begriffe sowohl unter Mono- als auch unter Kokulturbedingungen. In der Analyse wurden die PCA-Plots mit dem Paket ggplot2 in R gezeichnet.

Nach der mikroskopischen Bildaufnahme wurde die CellProfiler-Software (Broad Institute of Harvard und MIT, Version 3.1.9)43 verwendet, um zelluläre Merkmale (z. B. Zellgröße und Fluoreszenzintensität) abzuschätzen. Nach dem Laden des Satzes gefärbter Bilder (Kerne und Zellphänotyp oder -funktion) wurden alle Bilder mit den Modulen „correctilluminationCalcuate“ und „correctilluminationApply“ angepasst, um die ungleichmäßige Verteilung der Hintergrundsignale zu reduzieren. Die im Handbuch angegebenen Einstellungen wurden befolgt. Traditionell wird die Beleuchtungsfunktion aus „Hintergrund“ mit einer Blockgröße von 20–100 für jedes Bild einzeln berechnet. Und die Glättungsmethode wurde als „Medianfilter“ mit einer Filtergröße von 50 ausgewählt. Die anderen Optionen folgten den Standardeinstellungen. Die mathematische Methode von „correctilluminationApply“ war „Substract“. Mit den korrigierten Kernbildern wurden einzelne Zellen mithilfe der Otsu-Methode43 im Modul „IdentifyPrimaryObjects“ als Primärobjekte identifiziert, gefolgt von „IdentifySecondaryObjects“, um den zellulären Phänotyp/die Funktion automatisch zu bewerten. Anschließend wurden zelluläre Merkmale mithilfe der Module „MeasureObjectSizeShape“ und „MeasureObjectIntensity“ sowohl für primäre als auch für sekundäre Objekte berechnet. Eine weitere Analyse der morphologischen Deskriptoren einzelner Zellen wurde mit t-SNE in der Open-Source-Software Orange 3 (Version 3.23.1; Bioinformatiklabor, Fakultät für Computer- und Informationswissenschaften, Universität Ljubljana, Slowenien) durchgeführt91.

Der Ergebnisausdruck, die verwendeten statistischen Tests, die Stichprobengrößen und die Anzahl der unabhängigen Experimente werden in den Legenden der Abbildungen erwähnt. Alle zellbasierten Tests wurden in dreifacher Probenausführung mit drei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die Ridgeline-Diagramme und t-SNE-Analysediagramme basierten auf der Integration von drei unabhängigen Experimenten. Der Tukey-Kramer-Test und der Student-t-Test wurden mit R-Software (Version 3.5.2; https://www.r-project.org/) durchgeführt. Für mRNA-seq wurden alle Experimente mit mindestens zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die mRNA-seq-Daten wurden im NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) unter den Zugangsnummern GSE152091 und GSE206417 hinterlegt. Alle Manuskriptdiagramme und Diagramme der Ridgeline-Diagramme und der t-SNE-Analyse sind in den Zusatzdaten 1 bis 6 verfügbar.

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Die Autoren danken Frau Miyako Fujita und Dr. Satoshi Imamura für die technische Unterstützung. Die Finanzierung erfolgte großzügig durch die Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (16K14660, 17H02083, 18KK0306, 19H02572 und 21H01728), die Terumo Life Science Foundation, die Ebara Hatakeyama Memorial Foundation, die Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) ( 17937667) und LiaoNing Revitalization Talents Program (XLYC1902061). MT wurde von der Nakatani Foundation for the Advancement of Measurement Technologies in Biomedical Engineering unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde vom Nanotechnology Platform Project innerhalb von MEXT, Japan, durch den Kyoto University Nano Technology Hub unterstützt. WPI-iCeMS wird von der World Premier International Research Center Initiative (WPI), MEXT, Japan, unterstützt. Wir möchten uns auch bei Editage (www.editage.com) für die englischsprachige Bearbeitung bedanken.

Abteilung für Mikrotechnik, Universität Kyoto, Kyotodaigaku-Katsura, Nishikyo-ku, Kyoto, 615-8540, Japan

Jiandong Yang, Yoshikazu Hirai, Marika Trumm, Toshiyuki Tsuchiya und Osamu Tabata

Abteilung für Maschinenbau und Naturwissenschaften, Universität Kyoto, Kyotodaigaku-Katsura, Nishikyo-ku, Kyoto, 615-8540, Japan

Yoshikazu Hirai

Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Universität Kyoto, Yoshida Konoe-cho, Kyoto, 606-8501, Japan

In Iida

Fakultät für Naturwissenschaften und Technik, Kindai University, 3-4-1 Kowakae, Higashiosaka, Osaka, 577-8502, Japan

Kei Iida und Shinji Ito

Institut für integrierte Zellmaterialwissenschaften, Universität Kyoto, Yoshida-Ushinomiya-cho, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8501, Japan

Marika Trumm, Shiho Terada, Risako Sakai, Osamu Tabata und Ken-ichiro Kamei

Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie, Universität Heidelberg, Heidelberg, 69120, Deutschland

Marika Drum

Fakultät für Ingenieurwissenschaften/Graduate School of Engineering, Kyoto University of Advanced Science, Gotanda-cho, Yamanouchi, Ukyo-ku, Kyoto, 615-8577, Japan

Osamu Tabata

Wuya College of Innovation, Shenyang Pharmaceutical University, 110016, Liaoning, China

Ken-ichiro Kamei

Abteilung für Pharmazeutik, Shenyang Pharmaceutical University, 110016, Liaoning, China

Ken-ichiro Kamei

Programme für Biologie und Bioingenieurwesen, Abteilungen für Naturwissenschaften und Technik, New York University Abu Dhabi, Abu Dhabi, Vereinigte Arabische Emirate

Ken-ichiro Kamei

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JY, YH, TT, OT und KK konzipierten die Studie. JY und YH haben das Gerät hergestellt. JY, RS und ST führten die Zellkulturexperimente und -analysen durch. SI führte die UHPLC-MS/MS-Experimente durch. JY, RS, ST und KK führten die Bildanalyse durch. JY, ST und MT führten die RNA-Experimente durch. IK und KK führten die RNA-seq-Analysen durch. Alle Autoren trugen zur Datenanalyse, Diskussion und Interpretation bei. JY, YH und KK haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren geschrieben und überarbeitet.

Korrespondenz mit Yoshikazu Hirai oder Ken-ichiro Kamei.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Anam Akhtar und Christina Karlsson Rosenthal.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, J., Hirai, Y., Iida, K. et al. Integrierte Darm-Leber-auf-einem-Chip-Plattform als In-vitro-Menschenmodell für nichtalkoholische Fettlebererkrankungen. Commun Biol 6, 310 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04710-8

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Eingegangen: 25. Juni 2020

Angenommen: 14. März 2023

Veröffentlicht: 23. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04710-8

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